Why Use Total Organic Carbon Analysis For Cleaning Validation?
Part of the Cleaning Validation For The 21st Century series
ASTM E3106 Standard에서는 세척 밸리데이션에 사용되는 분석법의 선정은 “과학적이며 위험 기반(science- and risk-based)”이어야 하며, “사용 목적에 적합하고(fit for use) 정당화될 수 있는 방법을 사용하는 것이 목표”라고 명시하고 있다.
이전 기사에서는 ASTM Standard를 활용하여 과학적·위험 기반 접근법으로 분석법을 선정하는 방법을 다루었다. 본 기사에서는 세척 공정을 검증하는 데 있어 총유기탄소(TOC) 분석이 왜 가장 ‘사용 목적에 적합한’ 분석법인지 살펴보고자 한다. 특히 최근 강조되고 있는 과학적·위험 기반 접근 방식하에서 TOC의 활용은 충분히 과학적으로 정당화될 수 있다.
Why Use TOC?
거의 모든 의약품과 대부분의 부형제는 유기탄소 기반 화합물이다. 따라서 TOC는 주성분(API), 분해산물, 부형제 잔류물, 세정제 잔류물 또는 기타 유기탄소 잔류물을 검출하는 데 사용할 수 있다. TOC 분석은 단 한 번의 시험으로 이들 모든 유기탄소 성분의 존재(또는 부재)를 확인할 수 있다.
TOC는 흔히 유기탄소에 대한 ‘가이거 계수기(Geiger counter)’로 비유된다. 세척 밸리데이션의 목적이 “세척 후 아무것도 남아 있지 않음을 입증하는 것”이라는 점에서 TOC는 매우 이상적인 분석법이다. TOC는 이미 바이오테크 산업에서 수년간 널리 사용되어 왔으며, 제약 및 의료기기 산업의 다양한 응용 분야에도 매우 적합할 수 있다.
TOC는 비특이적(non-specific) 분석법이기 때문에, 분석 결과는 시료 내에 존재할 수 있는 모든 유기탄소 화합물의 총합을 의미한다. 이로 인해 하나의 TOC 결과를 바탕으로 여러 잔류물에 대한 평가가 가능하다.
즉, TOC 결과는 API, 분해산물, 세정제 또는 기타 유기 화합물로 환산하여 해석할 수 있다. 그림 1은 단일 TOC 결과를 여러 세척 허용기준과 비교 평가하는 방법을 보여준다.
그림 1: 1 ppm TOC 결과를 여러 화합물로 환산한 예시
본 예에서는 단일 TOC 결과(1 ppm)가 각각의 화합물에서만 기인한 것으로 가정하여 계산하였다. 만약 해당 1 ppm 값이 모든 화합물의 허용기준 중 가장 낮은 기준값(1.25 ppm)보다 낮다면, 시료에 존재할 가능성이 있는 모든 유기탄소 화합물에 대해 허용기준을 만족한다고 판단할 수 있다.
실제로는 TOC가 단일 물질에서만 기인할 가능성은 낮기 때문에, 이러한 가정은 보수적인 최악조건(worst case) 접근에 해당한다.
만약 결과가 특정 화합물의 허용기준 중 하나라도 만족하지 못할 경우, 어떤 화합물이 신호를 유발했는지 명확하지 않게 된다. 이 경우 부적합의 근본 원인을 조사하기 위한 후속 분석이 필요할 수 있으며, 해당 화합물을 식별하기 위해 잔여 시료를 HPLC 또는 micro-NIR와 같은 추가 분석에 적용할 수 있다.
(Nikunj Vasoya가 제작한 그래픽을 그의 허가를 받아 인용함)
TOC는 세척 밸리데이션에 사용하기에 이상적인 방법으로 보이지만, 그 적용과 관련하여 해결되어야 할 여러 가지 쟁점들이 존재한다.
Is TOC Accepted By Regulators?
현재까지도 FDA 및 기타 규제기관이 세척 밸리데이션에서 TOC를 인정하지 않는다는 오해가 존재한다. 그러나 이는 사실이 아니며, FDA는 이미 20여 년 전 웹사이트를 통해 TOC 사용이 과학적으로 정당화될 경우 허용 가능하다는 입장을 명확히 밝힌 바 있다.
Can "Water Insoluble" Compounds Be Analyzed By TOC?
TOC 사용을 위해서는 대상 화합물이 수용성이어야 한다는 주장이 제기되어 왔다. 많은 의약품이 “불용성(water insoluble)”으로 간주되기 때문에 이러한 화합물에 대해 TOC를 세척 밸리데이션 시험에 적용하는 것은 부적절하다는 해석으로 이어질 수 있다. 그러나 실제로는 가장 “불용성(water insoluble)”으로 분류되는 화합물조차도 일정 수준의 용해도는 존재한다.
표1은 미국약전(USP)에 정의된 “매우 녹기 어렵다(Very Slightly Soluble)” 및 “거의 녹지 않는다(Practically Insoluble)”에 대한 정의를 보여준다.
표 1: 미국약전(USP)에 따른 용해도 정의
표1에 제시된 농도(ppm)는 이론적으로 낮은 ppb(parts per billion; µg/L) 수준까지 내려갈 수 있는 TOC의 검출한계보다 상당히 높은 값이다. 또한 이러한 농도는 성공적으로 세척된 이후 일반적으로 관찰되는 TOC 잔류 수준(실무적으로 평균 약 150~200 ppb)보다도 훨씬 높다. 따라서 이론적으로 볼 때, 이러한 수준의 잔류물은 충분히 용해 가능하며 “불용성(water insoluble)”이라는 특성이 TOC 적용의 제한 요소가 되지는 않을 수 있다.
표2는 1996년 Johnson & Johnson(Ortho-McNeil)에서 Yaohai(Nick) Cao와 Andrew Walsh가 수행한 연구 결과를 보여준다. 이 연구에서는 시험 면적이 10 cm × 10 cm인 316L/#4 마감 스테인리스강 쿠폰에 설파제(sulfa drugs) 용액을 0.4 mg/cm² 수준으로 스파이킹하였다. 본 연구는 서로 다른 세 가지 설파제에 대해 수행되었다. 쿠폰은 TOC 함량이 낮은 용수(low TOC water)을 사용하여 3개의 스왑으로 채취되었으며, 스왑 헤드는 절단 후 20 mL의 low TOC water에 희석되었다. 스파이킹 수준, 스왑 면적 및 희석 부피는 시료 바이알 내 TOC 목표 농도가 2 ppm이 되도록 설계되었다. 이러한 설정의 근거는 세척 밸리데이션 시험에서 수집된 TOC 스왑 데이터의 약 99%가 1 ppm 이하였기 때문이다. 2 ppm 수준에서의 정량 회수는 기존 데이터가 신뢰할 수 있으며 실제 설비 잔류 수준을 대표한다는 강력한 근거가 된다. TOC 분석 후, 잔여 시료는 HPLC로 추가 분석하여 TOC 결과가 설파제에서 기인했음을 확인하였다.
표 2: TOC 및 HPLC를 이용한 설파 화합물의 수용성 및 스왑 회수율
참고: Sulfabenzamide 및 Sulfathiazole에 대한 Merck Index의 정의는 표1의 USP 정의 범위 사이에 해당한다.
획득된 데이터는 이러한 “불용성(water insoluble)” 화합물들이 2 ppm 수준에서 정량적으로 회수됨을 명확히 입증하였다. 이후 30년간 수행된 다수의 다른 “불용성(water insoluble)” 화합물에 대한 연구에서도 동일한 정량 회수 결과가 확인되었다. 물론 스왑 회수 시험을 위해서는 최소한의 수용성이 필요하지만, 실제로 용해도가 부족하다고 확인된 경우는 극히 소수의 화합물에 불과하다.
따라서 “insoluble,” “sparingly soluble,” “substantially insoluble,” 등의 용해도 정의는 TOC 사용을 반드시 배제하는 근거가 되지 않으며, 대부분의 의약품 화합물은 세척 후 일반적으로 관찰되는 수준에서는 스왑 용매로 물만 사용하더라도 정량 회수가 가능하다. 또한 일부 경우에는 인산으로 산성화된 물이 회수율을 현저히 향상시킬 수 있음이 연구를 통해 확인되었다.
Can TOC Actually Quantify What Is In The Sample?
TOC 사용과 관련하여 제기되는 질문 중 하나는 검출된 화합물의 실제 값이 불확실하다는 점이다. 즉, 실제 유기탄소 함량을 알 수 없기 때문에 TOC 1 ppm이라는 결과가 잔류물 관점에서 무엇을 의미하는지 명확하지 않다는 것이다. 따라서 그림 1과 같이 정확한 값으로 환산할 수 없으며, 결과가 “무엇이든 될 수 있다”고 주장되기도 한다.
이는 HPLC 분석 중 관찰되는 미확인 피크(unidentified peaks, extraneous peaks, unknown peaks 또는 ghost peaks)에도 동일하게 적용된다. 이러한 피크에 대한 흡광계수(extinction coefficient)가 없으면, 실제 값은 계산할 수 없다(그림 2).
그림 2: 미확인 피크가 나타난 크로마토그램 예시
Stevens Institute of Technology의 Pharmaceutical Manufacturing and Engineering Program 소속 대학원생들은 10년에 걸쳐 Merck Index(제12판)에 수록된 화합물 중 7,599종을 정리하였으며, 각 화합물의 탄소 함량(%)을 기록하거나 실험식(empirical formula)을 기반으로 계산하였다. Merck Index에 수록된 모든 항목이 유기탄소를 포함하는 것은 아니므로, 유기탄소를 포함하지 않는 항목은 분석 대상에서 제외되었다. 이 작업은 다수의 학생이 참여한 매우 방대한 작업이었으며, 최종적으로 7,599개 모든 화합물의 탄소 함량이 산출되었다. 그림3은 이들 7,599개 화합물의 탄소 함량 분포를 나타낸 히스토그램이다.
Figure 3: Histogram of % TOC for 7,599 Compounds from the Merck Index
그림 3: Merck Index에 수록된 7,599개 화합물의 TOC(%) 분포 히스토그램
이 데이터는 어느 정도 정규분포 형태를 보이지만, 명확하게 우측으로 치우친(skewed to the right) 분포를 나타낸다. 정규성 검정 결과(그림4), P-value가 0.005 미만으로 나타나 정규분포를 기반으로 한 통계 분석은 일반적으로 권장되지 않으며, 대신 로그정규분포(lognormal)와 같은 비정규 분포를 사용하는 것이 적절하다고 판단된다.
그러나 데이터의 왜도만을 기준으로 반드시 로그정규분포를 선택해야 하는 것은 아니라는 근거도 존재한다. 로그정규분포의 경우, 왜도와 관계없이 모집단의 대부분(95%)이 두 표준편차 이내에 존재한다는 점이 알려져 있다. 실제로 꼬리 부분(tails)에 해당하는 데이터는 많은 분석에서 중요하지 않을 수도 있다. 이러한 관점에서는, 데이터가 왜도를 보이더라도 정규분포를 모델로 선택하는 것이 정당화될 수 있다.
Figure 4: Probability Plot for the 7,599 Compounds from the Merck Index (12th Edition)
그림 4: Merck Index(제12판)에 수록된 7,599개 화합물의 확률도
그러나 이와 같이 정규분포를 따르지 않는 데이터의 경우, 비모수적(nonparametric) 기법을 대신 사용할 수 있다. 그림5는 전체 데이터의 99%를 포함하는 99% 허용구간(tolerance interval) 분석 결과를 보여주며, 하한은 8.14%, 상한은 93.28%로 나타났다.
Figure 5: 99% Tolerance Interval for the 7,599 Compounds from the Merck Index (12th Edition)
Merck Index(제12판) 7,599개 화합물에 대한 99% 허용구간
이 허용구간은 이후 대응되는 실제 값으로 변환되었으며, 비교를 위해 정규분포와 세 가지 비정규분포를 가정한 일반적인 통계 분석도 함께 수행되었다. 해당 분석 결과는 다음과 같다.
Table 3: 99% Tolerance Intervals for Merck Index Carbon Data. The data for the different distributions have been ordered based on the increasing result for the upper intervals.
표 3: Merck Index 탄소 데이터에 대한 99% 허용구간
각 분포별 데이터는 상한값이 증가하는 순서로 정렬되었다.
표3의 허용구간을 비교해 보면, 특히 상한값에서 분포별 결과가 서로 동일하지 않음을 알 수 있다. Weibull 분포만이 100% 이하를 유지한 반면, 정규분포, 감마분포 및 로그정규분포는 모두 100%를 초과하였으며, 특히 감마분포와 로그정규분포에서는 초과 폭이 매우 커 본 통계 분석에는 부적합한 것으로 판단되었다. 앞서 논의한 바와 같이, 꼬리 부분의 데이터가 중요하지 않은 경우에는 왜도를 가진 데이터에 로그정규분포를 적용하는 것이 허용될 수 있다. 그러나 본 분석에서는 바로 그 꼬리 끝 부분의 데이터가 핵심 관심 대상이다. TOC 결과가 1 ppm임에도 불구하고 그 탄소 함량이 100%를 초과한다고 가정한 후 다시 1 ppm 이하로 보정하는 것은 논리적이지 않다. 따라서 이러한 유형의 분석에는 비모수 접근법이 필요하다.
Figure 6: Example of a 1 ppm Sample Result Calculated Using Tolerance Intervals - In this example a single TOC sample result is calculated as a range of possible values based on the nonparametric tolerance interval analysis in Table 3. The probability for each value in this range is reflected in the histogram of the frequency of the data above the range.
그림 6: 허용구간을 적용하여 계산한 1 ppm 시료 결과 예시 – 본 예에서는 표3의 비모수 허용구간 분석을 기반으로 하나의 TOC 시료 결과(1 ppm)를 가능한 값의 범위로 환산하였다. 이 범위 내 각 값의 확률은 해당 범위 상단 데이터의 빈도 히스토그램에 반영되어 있다.
TOC를 사용할 경우, HPLC에서의 미확인 피크와 달리 실제 값이 포함될 확률이 99%인 범위를 99% 신뢰수준으로 계산할 수 있다. 따라서 그림 6에 제시된 것처럼 1 ppm 결과 또는 어떠한 TOC 결과라도, 비모수 허용구간을 적용함으로써 해당 시료에 존재했을 가능성이 있는 모든 화합물을 보다 정확하게 포괄하는 결과 범위로 환산할 수 있다. 만약 이러한 데이터에 Threshold of toxicological concern(TTC)와 같은 기준을 적용할 수 있다면, TOC는 설비 또는 의료기기의 청결도를 입증하기 위한 범용적인 도구로 활용될 수 있다.
Discussion
TOC 사용의 가장 중요한 장점 중 하나는 분석법 개발 및 밸리데이션이 크게 단순화된다는 점이다. 하나의 장비를 사용하는 단일 분석법만 필요하며, HPLC에서처럼 서로 다른 장비와 설정을 사용하는 다수의 분석법이 요구되지 않는다(UHPLC와 관련된 최근의 유망한 발전은 존재하지만). TOC 분석법은 한 번만 밸리데이션을 수행하면 되며, 이후에는 회수율 시험에 집중하면 된다. 분석법 설정이 간단하기 때문에 분석 속도는 다른 많은 분석법보다 빠르다. TOC 장비의 비용은 HPLC와 같은 장비에 비해 상당히 낮을 수 있으며, 총 소유 비용(overall cost of ownership) 또한 매우 낮다. 분석에 사용되는 주요 시약(예: 인산, 과황산암모늄)은 HPLC에서 사용되는 다수의 유기용매에 비해 매우 저렴하다. 이러한 특성으로 인해 TOC는 전체 밸리데이션 전략 및 장기적인 관점에서 매우 실용적이고 유용한 분석법이 된다.
Process Analytical Technology (PAT) Applications
TOC는 세척 밸리데이션 라이프사이클의 위험 관리 단계(risk control stage)에서 지속적인 모니터링 및 통계적 공정 관리(SPC) 프로그램에 대한 근거를 제공하는 데에도 적용될 수 있다. TOC는 at-line 공정분석기술(PAT) 접근 방식으로 쉽게 활용 가능하다(그림7). TOC는 신속한 분석법으로, 세척 공정 완료 직후 시료를 채취하여 수 분 이내에 분석할 수 있다. 이러한 at-line 접근 방식은 세척 완료 설비에 대한 매개변수기반 출하(parametric release)를 가능하게 하여 제조 공정 효율을 향상시킬 수 있다.
Figure 7: Example of a QbD 1200+ TOC Analyzer Setup Specifically for At-line PAT. QbD1200+ courtesy of Beckman Coulter.
그림 7: At-line 공정분석기술(PAT)을 위해 특별히 구성된 QbD 1200+ TOC 분석기 설정 예시. QbD1200+는 Beckman Coulter의 제공임.
TOC Combined With TN Analysis For Biopharmaceutical Applications
일부 TOC 시스템은 시료의 총질소(Total Nitrogen, TN)도 함께 분석할 수 있다. 이는 DNA, RNA, 단백질 및 펩타이드가 탄소와 질소를 모두 포함하며 일정한 탄소:질소(C:N) 비율을 갖는 바이오의약품의 경우 매우 유용하다. 화합물의 C:N 비율이 알려져 있다면, 해당 비율을 사용하여 세척 시료 내 잔류물의 수준을 추정할 수 있다. 예를 들어, 바이러스 단백질에 대한 연구에서는 평균 C:N 비율이 3.6:1로 확인되었다. 세척 시료의 C:N 비율이 해당 화합물의 알려진 C:N 비율과 일치한다면, 시료의 TOC 결과 전체가 해당 화합물에서 기인한 것으로 판단할 수 있다. 반면, 다수의 세정제와 같은 다른 잠재적 세척 잔류물은 질소를 포함하지 않는다. 따라서 이러한 세정제 잔류물이 세척 시료에 함께 존재할 경우, C:N 비율은 알려진 비율보다 커지게 된다. 이러한 접근 방식은 세척 시료의 구성 성분에 대한 추가 정보를 제공하며, 공정 잔류물에 대한 보다 정확한 평가를 가능하게 한다.
Summary
세척 평가를 위한 분석 방법의 선정은 반드시 과학적·위험 기반으로 이루어져야 한다. ASTM E3106에서 제시하는 위험평가의 주요 고려사항에는 공정 잔류물의 위해성(독성 점수, toxicity score), 공정 잔류물에 대한 노출 위험(Cpu 점수), 그리고 요구되는 검출 수준(예: CDI 점수)이 포함된다. 그 외에도 기존 분석법의 적용 가능성, 품질 및 규제 적합성 위험, 그리고 구현의 난이도나 장기적인 분석법 유지 관리와 같은 사업적 위험 요소도 고려될 수 있다. 적절한 위험평가와 분석법 밸리데이션이 수행된다면, 단순하고 비용 효율적이면서도 정확하고 신뢰성 있으며 정밀하고 규제 적합한 분석법은 다양한 공정 잔류물에 대해 적합할 수 있다.
과학적·위험 기반 분석법 선정에 관한 이전 기사에서 논의한 바와 같이, 검출한계가 낮은 분석법이 가장 바람직하다. 이에 따라 다음 기사에서는 TOC의 검출한계를 결정하는 방법과, 가능한 가장 낮은 검출한계를 확보하는 방법에 대해 설명할 예정이다.
